История открытия "серотонина" и его исследования

1.1 История открытия серотонина и методы его обнаружения

Прошло более 100 лет с тех пор, как серотонин привлек внимание ученых, и более полувека с момента разработки первого метода визуализации серотонина в мозге in situ (рисунок 1). Многие методы, которые играли решающую роль в идентификации серотонина и определении его биологической функции и метаболизма на заре его существования, больше не используются. Тем не менее, мы считаем, что краткий обзор ранней истории исследований серотонина может помочь нам взглянуть на используемые в настоящее время методы в перспективе и оценить технологический прогресс, достигнутый в этой области. В этом разделе будет рассмотрен вопрос об открытии серотонина и истории новаторских методов, используемых для измерения уровня серотонина в неврологии.

Хотя серотонин в настоящее время наиболее известен как нейромедиатор, впервые он был идентифицирован в сыворотке крови (бесклеточная жидкость из свернувшейся крови) как сосудосуживающее средство (Whitaker-Azmitia, 1999). Сообщается, что Людвиг и Шмидт были одними из первых ученых, которые наблюдали физиологический эффект серотонина в экспериментальных условиях, сообщив о своих результатах еще в 1868 году. Эти исследователи отметили, что дефибриногенизированная кровь при артериальном введении увеличивает сосудистое сопротивление в перфузированных мышцах собак. В последующие десятилетия эти наблюдения были воспроизведены и расширены другими учеными, включая Стивенса и Ли, а также Броди, которые также обнаружили, что обработка плазмы сульфатом магния, сульфатом натрия или цитратом натрия предотвращала ее сосудосуживающий эффект. Однако первоначально предполагалось, что вазоактивным ингредиентом в крови был адреналин. Только в 1911-1912 годах О'Коннор, работая над измерением концентрации адреналина в крови, определил, что неизвестный сосудосуживающий фактор отличается от адреналина и что его выброс в плазму происходит во время свертывания крови, предположительно из тромбоцитов. Эти результаты были подтверждены в 1913 году двумя независимыми исследованиями, проведенными Джейнвей и Парком, а также Стюартом и Цукером с использованием полосок из сонной артерии быка в биоанализе для выявления вазоконстрикции. Однако эти ранние исследования не были направлены на выделение или идентификацию активного ингредиента. Более систематические исследования начались в 1933 году, когда Виалли и Эрспамер сообщили об открытии энтерохромаффинных клеток в желудочно-кишечном тракте различных видов позвоночных. Это открытие привело к выделению нового вещества из энтерохромаффинных клеток кишечника кролика; было продемонстрировано, что это вещество, названное энтерамином, вызывает сокращение гладкой мускулатуры кишечника крысы и мыши и матки крысы. В 1946 году Эрспамер предположил индольную природу энтерамина на основе сравнительного анализа с использованием индольных алкалоидов в качестве эталонов, хотя он не смог определить его точную химическую структуру. Независимо от Эрспамера Пейдж работал над выделением мешающего сосудосуживающего средства, связанного со свертыванием крови, для изучения патогенеза эссенциальной гипертензии. В 1948 году в результате этих усилий Раппорт, Грин и Пейдж выделили соединение из бычьей сыворотки и из-за его обнаруженной функции сосудосуживающего средства назвали его серотонином. Слово "серотонин" было придумано Коркораном, коллегой Пейджа, и образовано путем сочетания латинского слова “сыворотка”, обозначающего вещество, в котором он был обнаружен, с греческим словом “тонизирующий”, обозначающим его наиболее раннюю идентифицированную функцию. В 1949 году Раппорт идентифицировал кристаллизованный серотонин как комплекс креатининсульфата и предположил, что его химическая принадлежность равна 5-НТ. Последующий химический синтез серотонина, проведённый Спитером в 1950 году, позволил компании Upjohn и Abbott наладить крупномасштабное производство этого вещества, сделав его доступным для многочисленных фармакологических и биологических исследований в различных системах. В конце концов, выделение энтерамина в чистом виде позволило Эрспамеру и Асеро идентифицировать его как 5-HT. Бак предположил, что термины «энтерамин» и «серотонин» следует заменить на 5-HT, поскольку первоначальные названия не отражают специфичность локализации и/или действия. Однако название «серотонин» сохранилось, и в современной литературе (в том числе в этом обзоре) термины «серотонин» и «5-HT» используются как взаимозаменяемые.

Методы селективной идентификации активных ингредиентов в тканевых экстрактах сыграли решающую роль в установлении серотонина как важного нейромедиатора, а также в понимании его роли, метаболизма и распределения в мозге. Старейшие биоанализы серотонина были основаны на изолированных тканях млекопитающих и моллюсков. К началу 1950-х годов Эрспамер, Пейдж, Уэлш и Гуддам разработали и использовали ряд чувствительных количественных биологических анализов для определения концентрации серотонина во множестве препаратов. В 1952 году (хотя оригинальная рукопись, сообщающая об этом открытии, не публиковалась до 1954 года) Тварог, работая в Гарвардском университете, идентифицировал 5-НТ как расслабляющий нейромедиатор в мышцах, что сделало его третьим обнаруженным нейромедиатором после ацетилхолина (1933) и норадреналина (1946), присутствие которых было подтверждено на периферическом уровне. Это открытие позволило Тварогу предположить, что 5-НТ может присутствовать в мозге млекопитающих. Соответственно, в 1953 году Тварог и Пейдж обнаружили серотонин в мозге нескольких млекопитающих, в частности собак, крыс и кроликов с использованием сверхчувствительного биоанализа на основе изолированного сердца Venus mercenaria (ныне переименованного в Mercenaria mercenaria). Независимо друг от друга в 1954 году Амин, Кроуфорд и Гаддум использовали изолированную эстральную матку в биоанализе для определения распределения 5-НТ в мозге собаки. Эти новаторские открытия привели 5-НТ в область неврологии и положили начало множеству исследований, посвященных его функции в мозге.

Появление новых инструментальных и аналитических методов обнаружения низкомолекулярных соединений, которые начали процветать в конце 1950-х годов, значительно расширило инструментарий для изучения функции серотонина в мозге и в конечном итоге заменило тканевые биоанализы. Одной из первых вех в технологическом развитии аналитических методов определения серотонина стала разработка спектрофотофлуорометра в 1955 году. Это новое оптическое оборудование позволило использовать чувствительные методы измерения концентрации моноаминов, включая серотонин, в головном мозге, предлагая более высокую пропускную способность и большую простоту, чем биоанализы изолированных тканей. Как индол, серотонин может быть обнаружен непосредственно благодаря его естественной ультрафиолетовой флуоресценции (с максимумами возбуждения и излучения при 297 и 337 нм соответственно), что типично для ароматических соединений. Однако реакция серотонина с другими химическими веществами, такими как нингидрин и о-фталевый альдегид, использовалась для повышения селективности и чувствительности прямых измерений на порядок. Тем не менее, присутствие интерферирующих или перекрестно реагирующих соединений в биологических образцах ограничивает применение спектрофотофлуорометрических методов. Дальнейшая разработка более совершенных методов молекулярного разделения и детекции, включая хроматографию, масс-спектрометрию, иммуноанализы и т.д. позволили не только преодолеть эти ограничения, но и улучшить специфичность и чувствительность обнаружения серотонина. Аналитические методы по-прежнему широко используются для измерения уровня серотонина в различных биологических образцах и предоставили обширные знания о физиологии серотонина в состоянии здоровья и болезнях. Однако эти методы часто основаны на извлечении серотонина из гомогенатов тканей и, следовательно, несовместимы с измерениями in vivo. Первым методом, который позволил визуализировать моноамины, включая серотонин, in situ с субклеточным разрешением, был метод Фалька-Хилларпа, представленный в 1962 году. Визуализация катехоламинов и серотонина in situ была достигнута благодаря образованию желто-зеленых флуоресцентных молекул изохинолина во время воздействия паров формальдегида на лиофилизированную ткань. Используя этот метод в 1964 году, Дальстрем и Фуксе визуализировали и нанесли на карту серотонинергические нейроны в мозге крысы, классифицировав их на девять отдельных кластеров, обозначенных от B1 до B9. Однако метод Фалька-Хилларпа не получил широкого распространения из-за необходимости специального оборудования и высококвалифицированного персонала для получения оптимальных результатов окрашивания; поэтому в 1980-х годах его быстро заменила иммуногистохимия, чему способствовала разработка антител к 5-НТ Steinbusch et al. В настоящее время иммуногистохимия остается одним из основных методов визуализации серотонина in situ, наряду с недавно разработанной масс-спектрометрией визуализации.

Ранние методы обнаружения серотонина в мозге, рассмотренные в этом разделе, позволили провести важные исследования, которые способствовали открытию серотонина и выяснению его распределения и встречаемости в мозге; однако они не были совместимы с измерениями in vivo. Методы электрохимии и микродиализа, о которых сообщалось в начале 1970-х годов, были первыми методами, использованными для обнаружения и измерения серотонина in vivo у ведущих себя животных. В настоящее время эти подходы остаются популярными для фундаментальных нейробиологических исследований. Самые первые документированные измерения распределения и метаболизма серотонина в головном мозге человека были достигнуты с помощью позитронно-эмиссионной томографии и функциональной магнитно-резонансной томографии (ФМРТ), которые являются основными методами биомедицинских и клинических исследований серотонинергической системы. Самая современная технология визуализации динамики серотонина in vivo основана на недавно разработанных генетически кодируемых флуоресцентных биосенсорах. Флуоресцентные биосенсоры — это наиболее быстро развивающиеся инструменты с большим потенциалом для мультиплексной визуализации у животных.